细胞培养通用指南
实验室培养的细胞，按照细胞类型划分，大致可分为以下三类。
（1）贴壁细胞：细胞粘附于培养容器（例如组织培养塑料）。
（2）悬浮细胞：所有细胞都随生长培养基悬浮生长，并不附着在培养容器上生长。
（ 3）半贴壁细胞：一些细胞松散地粘附在培养容器上，另一些细胞可能悬浮在生长培养基中。
细胞也可以根据其生长特性进行分类，分为有限增殖和无限增殖：
有限增殖：仅增殖并维持有限数量的群体倍增活力。常见的例子是直接从组织中分离的原代细胞，或在一定次数的传代后停止生长（衰老）的细胞系。
无限增殖：具有无限分裂能力的细胞（永生化）。通常通过转化产生，以获得类似癌症的表型（例如失去接触抑制、无限生长）。
本文我们将重点介绍最常见的细胞类型：贴壁细胞和悬浮细胞。请注意：所有涉及培养细胞操作的程序都应使用无菌技术和适当的控制方法进行。
第 1 阶段 冷冻保存
遗传不稳定性在持续培养的细胞中不断积累。因此，应在收到细胞系后尽快将其冷冻并储存。这可确保细胞库存在遗传上尽可能接近源材料，并降低污染风险。冷冻过程应在有冷冻保护剂（如DMSO）的情况下以可控方式（理想情况下以每分钟1°C的速度）冷冻细胞，以防止细胞内形成冰晶并导致培养物活力丧失。
实验步骤
1.使用显微镜观察细胞，检查其整体外观，确保没有微生物污染的迹象。同时，确保细胞处于对数增长阶段，细胞密度不应超过细胞系的指导范围，活力一般应大于90%。
2.按照标准传代培养方法收集并计数细胞。悬浮细胞以每毫升2 - 5×106个细胞的密度冻存，贴壁细胞以每毫升1 - 2×106个细胞的密度冻存。
3.根据细胞系特点，选择合适的冷冻保护剂，同时根据细胞数量计算所需的冷冻液，按照配方配置冷冻液。
注意，如果冷冻液中添加DMSO，因DMSO添加时会释放热量，尽量提前配置。
4.以200 × g离心细胞悬浮液5分钟，去除上清液，并将细胞沉淀物重新悬浮在PBS中。
5.以200 × g离心5分钟，去除上清。
6.用配置好的冷冻液重悬细胞沉淀，充分混匀后，转移到适当数量的冻存管中，并标记日期、名称、细胞编号、传代数和细胞类型等重要信息。
7.将冻存放入冻存盒中，在-80°C下放置一夜。这样可以控制温度下降。
8.转移到液氮罐中长期储存。
第二阶段 细胞复苏
需要使用时，应尽快解冻细胞，以尽量减少对细胞活力的不利影响。建议在复苏时通过离心将冷冻保存剂从培养基中去除。
实验步骤
1.从液氮储存中取出冷冻管并放入37°C水浴中，轻轻晃动管子，加速解冻，仔细监测小瓶，当管内解冻至黄豆大小时可将冻存管从水浴锅中取出。
2.将冻存管内细胞（1 ml）转移至装有预热培养基（4 ml）的15 ml离心管中，200 - 250 × g，离心5分钟。
注，离心速度和时间仅供参考，可根据具体实验要求调整。
3.除去上清液并重新用适量预热培养基重悬细胞沉淀，选择合适的接种密度，把细胞接种至相应的培养容器中进行培养。
4.根据细胞类型需要，添加对应所需的生长因子等成分。
第 3 阶段 观察
应定期用显微镜和肉眼观察细胞是否有微生物污染迹象。还应使用显微镜检查来确定细胞的总体健康状况并确定是否需要进行传代培养。
实验步骤
1.用肉眼观察细胞培养的状态，排除污染。
对于贴壁细胞，生长培养基应该是清澈的。如果不是，这可能是污染的迹象，或者细胞已经超过汇合度并且正在死亡或从培养表面脱落。
对于悬浮细胞，由于溶液中悬浮着细胞，培养基会更浑浊。如果浑浊度比预期的要高，再加上酸性培养基，可能表示存在污染或细胞密度高，需要进行传代培养。
温度水平、二氧化碳和成分的代谢都会影响生长培养基的pH值。
2.通过以下几个方面，在光学显微镜下观察细胞的生长或是否污染等情况。
细胞贴壁。确保细胞粘附于培养容器，或如预期那样处于悬浮状态。
细胞形态。检查培养物以确认细胞形态符合预期。形态不同可能是污染或分化的征兆。
融合度（针对贴壁细胞）。这是细胞覆盖细胞培养表面的百分比。100%表示细胞完全覆盖培养容器表面。细胞需要进行亚培养的百分比取决于细胞系，但最常见的是70%。
细胞密度。通过进行细胞计数来监测悬浮细胞的健康和生长特性。收集细胞样本并使用血球仪或自动细胞计数器进行细胞计数。细胞系需要进行传代培养的密度取决于细胞系。
注意定期对细胞进行检测，排除支原体污染，同时在培养过程中，持续监测细胞是否有细菌、真菌和酵母污染的迹象。不同的细胞系也可能污染培养物。
第四阶段 细胞维持和传代培养
如果细胞生长健康且达到了所需的汇合度，则可以进行传代培养和/或接种细胞以供实验使用。
如果细胞尚未达到所需的汇合度，并且自上次传代培养以来已过去2-3天，则更换培养基并继续，直到达到所需的汇合度。
如果细胞出现污染迹象，则应将其丢弃。
● 更换培养基
培养细胞时需要定期更换培养基，以防止有毒代谢物（例如乳酸）的积累，并确保生长培养基成分的持续供应。细胞代谢物的积累通常通过pH指示（例如酚红）进行监测，并以此确定完成细胞培养基更换的合适时间。
实验步骤
1.吸取生长培养基。
对于悬浮细胞，先将培养物转移至离心管，以200-250 × g的速度离心5分钟，去移除培养基。
对于贴壁细胞，将培养容器略微倾斜，直接吸出培养基，注意不用完全吸干净。
2.重新添加新鲜的生长培养基。
对于悬浮细胞，用适量新鲜生长培养基重悬细胞沉淀，混匀后转移到新的培养容器中。
对于贴壁细胞，直接沿壁加入适量的新鲜生长培养基。
3.将培养容器及时放入培养箱中进行培养，继续监测细胞的生长情况和污染迹象。
● 传代培养
如果细胞生长到所需的汇合度或密度，则应进行继代培养。继代培养也称为传代，是将细胞从之前的培养物转移到新的培养容器中，加入新鲜培养基，以继续生长。
实验步骤
1.清洗并收集细胞。
对于悬浮细胞，将培养物转移至离心管，以 200-250 × g的速度离心5分钟。除去培养基并将细胞沉淀物悬浮在适当体积的PBS中，清洗一遍，离心去除PBS。
将细胞沉淀重悬于新鲜生长培养基中。
对于贴壁细胞：
（1）将培养容器略微倾斜，直接吸出培养基，添加适当体积的PBS清洗，确保细胞培养物被覆盖，吸出并丢弃PBS。
（2）添加适当的消化酶，如胰蛋白酶，并在37°C下孵育，直至细胞分离。
（3）添加新鲜培养基并将细胞悬浮液转移到离心管中。
（4）以200-250 × g的速度离心5分钟。
（5）除去培养基并将用适当体积的PBS重悬细胞沉淀，混匀充分清洗。
（6）以200-250 × g的速度离心5分钟。
（7）吸出并丢弃PBS，将细胞沉淀重悬于新鲜生长培养基中。
注意：培养容器所需的任何包被涂层都应在细胞分离之前进行。
2.选择适合传代稀释比例，将适量的细胞接种到新的培养容器中，添加生长培养基至所需体积。
3.在培养容器上标注关键信息，包括细胞类型、传代次数、接种密度/分裂比、日期和操作人等。并按要求进行孵育。
4.继续每天监测细胞的生长情况和污染迹象。
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